प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: विधि के सिद्धांतों

अवशोषण और प्रकाश आगे अकार्बनिक और कार्बनिक तरल पदार्थ की फिर से उत्सर्जन स्फुरदीप्ति या प्रतिदीप्ति का परिणाम है। घटना के बीच का अंतर अवशोषण और प्रकाश प्रवाह के उत्सर्जन के बीच अंतराल की अवधि है। इन प्रक्रियाओं के प्रतिदीप्ति लगभग एक साथ होते हैं जब जबकि स्फुरदीप्ति, - कुछ देरी के साथ।

ऐतिहासिक जानकारी

1852 में, ब्रिटिश वैज्ञानिक स्टोक्स, पहले प्रतिदीप्ति का वर्णन किया। उन्होंने कहा कि के साथ प्रयोग का एक परिणाम के रूप में एक नया शब्द शुरू की एक प्रकार का धात्विया, जो पराबैंगनी प्रकाश के तहत लाल प्रकाश का उत्सर्जन। स्टोक्स एक दिलचस्प घटना का उल्लेख किया। यह पाया गया है कि फ्लोरोसेंट विकिरण के तरंगदैर्ध्य हमेशा उत्तेजना प्रकाश के प्रवाह से अधिक है।

19 वीं सदी में परिकल्पना की पुष्टि करने के कई प्रयोगों किया गया है। वे पता चला है कि नमूने की एक किस्म पराबैंगनी प्रकाश के प्रभाव में प्रतिदीप्त होती हैं। सामग्री के अलावा, अन्य बातों के लिए किया गया क्रिस्टल, रेजिन, खनिज, क्लोरोफिल, कच्चे दवाओं, अकार्बनिक यौगिकों, विटामिन, तेल के बीच में। जैविक परीक्षण के लिए रंगों की प्रत्यक्ष उपयोग केवल 1930 में शुरू हुआ

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: वर्णन

20 वीं सदी के अध्ययन की पहली छमाही में इस्तेमाल की गई सामग्री में से कुछ उच्च विशिष्टता का प्रदर्शन किया। стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. प्रदर्शन है, जो तरीकों विषम द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सका के लिए धन्यवाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की विधि जैव चिकित्सा और जैविक अनुसंधान में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है। उतना ही महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त, और सामग्री के लिए किया गया था।

? क्या फायदे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की विधि क्या है? नई सामग्री का प्रयोग संभव हो गया है और बहुत ही विशेष सेल submicroscopic घटकों के चयन। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एकल अणुओं का पता लगा सकते। रंगों की एक किस्म एक साथ अनेक आइटम की पहचान की अनुमति। उपकरण है, जो, बारी में, नमूने के विशिष्ट गुणों पर निर्भर करता है के विवर्तन सीमा के सीमित स्थानिक संकल्प के बावजूद, इस स्तर से नीचे अणुओं की पहचान भी काफी संभव है। विकिरण प्रदर्शनी autofluorescence के बाद विभिन्न नमूने हैं। इस घटना को व्यापक रूप से शिला, वनस्पति विज्ञान, अर्धचालक उद्योग में प्रयोग किया जाता है।

विशेषताएं

जानवरों के ऊतकों या रोगाणुओं अक्सर जटिल या बहुत कमजोर है या बहुत मजबूत unspecific autofluorescence का अध्ययन करें। हालांकि, अध्ययन में मूल्य सामग्री घटक एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित में परिचय और आवश्यक प्रकाश प्रवाह तीव्रता उत्सर्जक प्राप्त कर लेता है। Fluorochromes स्वतंत्र रूप से करने में सक्षम रंगों ढांचे (दृश्य या अदृश्य) से जुड़ी के रूप में कार्य। इस प्रकार वे लक्षित करने के लिए एक उच्च चयनात्मकता, और क्वांटम उपज है।

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से प्राकृतिक और सिंथेटिक रंगों के आगमन के बाद इस्तेमाल किया गया है। वे उत्सर्जन और उत्तेजना के कुछ तीव्रता प्रोफाइल के पास और विशिष्ट जैविक लक्ष्यों को निशाना बनाया।

व्यक्तिगत अणुओं की पहचान

अक्सर, आदर्श स्थिति में, तो आपको एक अलग तत्व चमक रजिस्टर कर सकते हैं। इस के लिए, अन्य बातों के अलावा, यह आवश्यक डिटेक्टर और ऑप्टिकल पृष्ठभूमि के एक पर्याप्त रूप से कम शोर प्रदान करना है। कारण फेंकना कर सकते हैं अप करने के लिए 300 हजार। फोटॉनों photobleaching के लिए विफलता के लिए Fluorescein अणु। प्रक्रिया का 20% संग्रह क्षमता पर और उनके बारे में 60 हज़ार की राशि में रजिस्टर कर सकते हैं।

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. हिमस्खलन फोटोडिओड या इलेक्ट्रॉनिक गुणन के आधार पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, शोधकर्ताओं ने दूसरे के माध्यम से व्यक्तिगत अणुओं के व्यवहार का निरीक्षण करने की अनुमति दी, और कुछ मामलों में भी मिनट।

जटिलता

ऑप्टिकल शोर पृष्ठभूमि के दमन के पक्ष में एक महत्वपूर्ण मुद्दा। तथ्य यह है कि फिल्टर और लेंस कुछ autofluorescence प्रदर्शन के डिजाइन में इस्तेमाल की गई सामग्री के कई, प्रारंभिक दौर में वैज्ञानिकों के प्रयासों के लिए एक कम प्रतिदीप्ति होने घटकों के उत्पादन के लिए उन्मुख थे के कारण। हालांकि, बाद के प्रयोगों नए निष्कर्ष हुई है। , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. विशेष रूप से, यह पाया गया कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, कुल आंतरिक प्रतिबिंब के आधार पर, यह एक कम पृष्ठभूमि और उच्च तीव्रता उत्तेजना प्रकाश को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।

तंत्र

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों, कुल आंतरिक प्रतिबिंब के आधार पर क्षणभंगुर लहर या क्षणभंगुर का उपयोग है। यह अलग के साथ मीडिया के बीच की सीमा पर होता है अपवर्तक सूचकांक। इस मामले में, प्रकाश किरण चश्मे से होकर गुजरता है। यह एक उच्च अपवर्तनांक पैरामीटर है।

चश्मे कम पैरामीटर के साथ जलीय घोल या कांच के निकट। एक कोण है कि और अधिक महत्वपूर्ण है पर यह निर्देश दिया प्रकाश की किरण हैं, तो किरण पूरी तरह से इंटरफ़ेस से परिलक्षित होता है। यह घटना, बारी में, nonpropagating तरंगों का कारण बनता है। दूसरे शब्दों में, उत्पन्न विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र जो एक दूरी कम से कम 200 नैनोमीटर के लिए एक कम अपवर्तनांक पैरामीटर के साथ एक माध्यम में प्रवेश।

क्षणभंगुर लहर प्रकाश की तीव्रता fluorophores उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त होगा। हालांकि, इसकी अत्यंत छोटे गहराई की वजह से है, इसकी मात्रा बहुत छोटा हो जाएगा। परिणाम एक निम्न स्तर पृष्ठभूमि है।

परिवर्तन

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कुल आंतरिक प्रतिबिंब पर आधारित है, एपि रोशनी के साथ लागू किया जा सकता है। यह उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ लेंस की आवश्यकता है (कम से कम 1.4, लेकिन यह वांछनीय है कि यह 1.45-1.6 पर पहुंच गया है), और आंशिक रूप से क्षेत्र तंत्र प्रबुद्ध। बाद के एक छोटे से स्थान आकार के साथ हासिल की है। अधिक से अधिक एकरूपता के लिए एक पतली अंगूठी है, जो धारा के एक हिस्से द्वारा अवरुद्ध है का उपयोग कर। महत्वपूर्ण कोण, जिसके बाद वहाँ एक कुल प्रतिबिंब है के लिए, हम लेंस में विसर्जन मध्यम और माइक्रोस्कोप के कवर कांच के अपवर्तन के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है।